Diagnosi e monitoraggio virologici dell'infezione HIV

 

 

Premessa

 

La storia dell’AIDS (Acquired immuno-deficiency sindrome o Sindrome da immuno-deficienza acquisita) è iniziata nel Giugno 1981, quando il CDC (Centers for Disease Control and Prevention) di Atlanta, negli U.S.A., segnalò la presenza di casi di polmonite da  Pneumocystis carinii (un microrganismo a metà strada tra protozoi e miceti, sino ad allora noto per la capacità di causare una rara forma di polmonite, esclusivamente in soggetti affetti da una evidente compromissione del sistema immunitario, come i nati prematuri o i soggetti con deficit genetici della risposta immune) in diversi omosessuali maschi di Los Angeles. Si vide subito che la patologia (inizialmente definita “gay pneumonia” o “polmonite dei gay”) si accompagnava alla presenza di sostanziali lesioni del sistema immune che, non essendo legate alla presenza di alterazioni genetiche, era necessario ammettere fossero state acquisite tardivamente, per cause esterne. Poco dopo, si mise in evidenza che, oltre alla polmonite da Pneumocystis carinii, e non solo tra gli omosessuali di sesso maschile, ma anche tra i tossicodipendenti o i soggetti sottoposti a trafusione di sangue o a somministrazione di emoderivati, era evidenziabile, sia pure con diversa frequenza, la comparsa di infezioni o di manifestazioni tumorali (sarcoma di Kaposi) raramente riscontrabili in soggetti capaci di una normale risposta immune. Nel 1982 questo insieme di patologie vennero comprese nella denominazione di “Sindrome da immunodeficienza acquisita”  (AIDS: Acquired ImmunoDeficiency Sindrome) e, anche per la presso che contemporanea dimostrazione della possibilità di trasmissione materno-fetale della patologia, si ipotizzò che alla sua radice dovesse trovarsi un agente infettante (un virus), in grado di trasmettersi soprattutto con il sangue (durante rapporti sessuali, con le trasfusioni, per via diaplacentare dalla madre al feto, etc) e capace di colpire elettivamente le cellule coinvolte nella risposta immunitaria.

Nel 1983 Luc Montagnier in Francia e Robert Gallo negli U.S.A. sono riusciti ad identificare il virus responsabile dell’AIDS, virus oggi denominato HIV (human immunodeficiency virus) e di cui si conoscono due tipi, denominati rispettivamente HIV-1 ed HIV-2, tra i quali HIV-1 è il tipo largamente più diffuso e di maggiore patogenicità.

L’identificazione e l’isolamento in colture cellulari del virus responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita, ha reso possibile la preparazione di una serie di reagenti diagnostici, alcuni dei quali (preparazioni di antigeni virali), disponibili in commercio sin dal 1985, hanno reso immediatamente possibili le procedure diagnostiche per l’accertamento di infezione oggi definite di “primo livello” e lo screening preliminare dei donatori di sangue o di organo, nonchè le preparazioni di immunoderivati, consentendo di portare il rischio di trasmissione dell’infezione (almeno il rischio iatrogeno, ovverosia quello legato a procedure o interventi sanitari) a livelli assai prossimi allo zero.

 

 

Dal 1985 ad oggi, sono stati compiuti numerosi progressi nelle conoscenze sulla patogenesi della malattia, nei procedimenti diagnostici e nelle applicazioni terapeutiche.

Tuttavia l’AIDS rimane ancora oggi una malattia gravemente invalidante sia sul piano fisico sia sul piano psicologico e delle relazioni sociali e, quello che più conta, rappresenta una patologia che, nella quasi totalità dei casi, è destinata a concludersi, anche se dopo un periodo di tempo molto più lungo che in passato, nel definitivo collasso del sistema immunitario e nell’esito infausto.

La grande variabilità antigenica di HIV, il fatto che, come tutti i retrovirus, HIV sia in grado, già nella prima fase di contatto con l’organismo, di inserire il proprio genoma - in forma di DNA provirale - nel genoma di una serie di cellule bersaglio specifiche, alcune delle quali rappresentano veri e propri santuari protetti dagli effettori della risposta immune e la mancanza di efficacia della risposta immune che si verifica nel corso dell’infezione naturale, con la conseguente totale assenza di “guarigioni spontanee”, sono tutti fattori che rendono l’allestimento di un vaccino preventivo estremamente improbabile. La prevenzione della malattia, quindi, è (ed è destinata a rimanere per lungo tempo) esclusivamente legata alla adozione di  misure efficaci nel prevenire il contagio. Nel caso dell’infezione iatrogena, come abbiamo già detto, lo screening accurato dei donatori di sangue, dei donatori di organi o tessuti per i trapianti, il controllo delle preparazioni di emoderivati, l’isolamento funzionale e la corretta gestione dei pazienti infetti da HIV, etc, hanno praticamente azzerato il rischio di trasmissione dell’infezione legato ad interventi sanitari. Più difficile è, ovviamente, la situazione nella normale popolazione, soprattutto nei Paesi in via di sviluppo (ai quali appartiene più dell’80% dei circa 40 milioni di casi di AIDS presenti nel mondo alla fine del 2001) o in collettività con peculiari atteggiamenti culturali (tossicodipendenti, prostitute, etc).

Almeno nei Paesi industrializzati, comunque, ed a partire dalla metà degli anni ’90, si è osservata una tendenza alla diminuzione di nuovi casi di AIDS, da collegare probabilmente all’ingresso, più o meno consapevole, di norme comportamentali adeguate in ampi strati della collettività, anche se, negli ultimi due o tre anni, la tendenza alla diminuzione è sempre meno evidente ed il numero di nuovi casi sembra tendere alla stabilizzazione intorno a cifre ancora consistenti, da riferire evidentemente ad atteggiamenti e comportamenti “a rischio” di una quota di popolazione incomprimibile senza l’intervento di programmi di educazione/informazione sanitaria adeguati.  Va inoltre sottolineato che l'aumento della sopravvivenza determina un incremento del numero di persone sieropositive viventi  (che, in Italia, si stima ormai vicino a 110 mila). Pertanto, anche se i successi della terapia sono notevoli e hanno contribuito alla diminuzione di casi di malattia conclamata e a un crollo dei decessi, si rileva un aumento globale dell'impatto dell'epidemia (rischio di trasmissione dell’infezione) a livello di popolazione.

 

 

La diagnosi di infezione: generalità

 

La diagnosi di infezione in atto è possibile, normalmente, attraverso la dimostrazione della presenza di un microrganismo patogeno o di un virus o di loro tracce non equivoche (antigeni specifici, peculiari sequenze genomiche o di RNA-ribosomiale, trascritti specifici, etc.), in un adeguato campione di materiale patologico. Nel caso in cui non sia possibile perseguire questa strada e in presenza di precisi sospetti eziologici, si possono ricercare indicazioni indirette della presenza di un'infezione, mediante indagini intese a svelare l'esistenza di una specifica risposta immune umorale.

Di norma, però, la mera rilevazione della presenza nel siero di un paziente di anticorpi (IgG) specifici per un determinato agente di infezione (quando si possa escluderne l'origine da vaccinazioni o dalla somministrazione di emoderivati) è solo l'indizio di una pregressa infezione ma non è sufficiente a porre la diagnosi di infezione "in atto", alla quale, come è noto, le indagini siero-immunologiche possono portare solo in alcuni casi e solo quando esse siano condotte con particolari accorgimenti tecnici e diano precisi risultati [comparsa (sieroconversione) o aumento significativo del titolo di anticorpi (IgG) specifici, presenza di IgM specifiche, presenza di anticorpi (IgG o IgM, a seconda dei casi) nei confronti di antigeni espressi solo nella fase iniziale dell'infezione (antigeni virali "precoci"), presenza di anticorpi (IgG) a bassa avidità, etc.].

 

 

La diagnosi di infezione da HIV

 

Essendo l’infezione da HIV un’infezione persistente e, anzi, l’infezione virale persistente paradigmatica, la diagnosi di infezione rappresenta, per alcuni versi, un'eccezione a quanto detto in precedenza.

L’infezione da HIV, infatti, è seguita dalla costante e progressiva replicazione del virus in una serie di organi bersaglio ed è [anche se per un lungo periodo di tempo (anni) può essere in qualche modo contenuta dalla risposta immune dell'organismo e non accompagnarsi a sintomi clinici evidenti (latenza clinica)]  ineluttabilmente (o quasi) destinata a sfociare nella definitiva compromissione del sistema immunitario e nella comparsa della sintomatologia clinica.

Poiché, quindi, l'infezione da HIV, una volta verificatasi, si mantiene costantemente "attiva", la "sieropositività", ovverosia la mera rilevazione della presenza di anticorpi specifici per HIV nel siero di un individuo, consente di porre inequivocabilmente la diagnosi di infezione "in atto" (anche se clinicamente silente).

 

La ricerca di anticorpi anti-HIV viene eseguita  mediante saggi immunoenzimatici (ELISA: enzyme lynked immonosorbent assay)  nei confronti di preparazioni antigeniche virus-specifiche altamente purificate, scelte nell’ambito di quelle autorizzate dal Ministero della Sanità, e le cui caratteristiche consentano la rilevazione di anticorpi (IgG) nei confronti di HIV-1 (inclusi gli stipiti con una fisionomia antigenica meno frequente, come i cosiddetti stipiti outlier o stipiti “O”) e HIV-2. Anche se le preparazioni di antigeni virali oggi in uso consentono di considerare i risultati positivi altamente specifici, è generalmente considerato utile confermare un risultato positivo alla metodica ELISA nei confronti di una miscela di antigeni virus-specifici, mediante un ulteriore test di  immunoblotting o Western blotting che consente di evidenziare la presenza di anticorpi contro le singole proteine virus-specifiche separate in base al peso molecolare e singolarmente identificabili come effettivamente appartenenti al virus[1].

Pur consentendo, di norma, una sicura diagnosi di infezione, la ricerca di anticorpi presenta però precisi limiti di utilizzo in almeno tre circostanze: 1) nella fase iniziale (3-4 settimane) dell'infezione nella quale la quantità di anticorpi circolanti non è ancora sufficiente ad essere evidenziata dalle tecniche di rilevazione disponibili (la cosiddetta "finestra" iniziale), 2) nei neonati da madri infette da HIV, i quali  possiedono anticorpi sierici anti-HIV di origine materna e, quindi, di nessun valore diagnostico per l’accertamento di infezione nel neonato, 3) in quella (generalmente modesta) percentuale di soggetti infetti in cui i risultati delle indagini sierologiche possono dare risultati di dubbia positività (i cosiddetti risultati "borderline”) che propongono una difficile interpretazione.

Quando sia necessario accertare la presenza di infezione in situazioni in cui non sia possibile fare affidamento sulle indagini sierologiche o, comunque, in presenza di risultati dubbi di queste ultime, è necessario ricorrere alla ricerca del virus.

La ricerca di HIV può essere condotta tentando di dimostrare la presenza di virus infettante nei linfomonociti circolanti mediante isolamento del virus in colture cellulari in vitro (si tratta però di una tecnica relativamente indaginosa e che comunque richiede tempi relativamente lunghi e laboratori particolarmente attrezzati e che ha una precisa indicazione pressocchè esclusivamente nel monitoraggio delle varianti antigeniche circolanti in un determinato territorio) oppure, più agevolmente, tentando di dimostrare la presenza  di antigeni virus-specifici nel plasma (ricerca della proteina p24 del "core" o capsìde virale) o di specifiche sequenze nucleotidiche (DNA provirale nei linfomonociti circolanti, RNA virionico nel plasma).

Anche se la ricerca di proteina p24 o RNA virionico nel plasma rappresentano strumenti di elevata sensibilità ai fini diagnostici, va sottolineato che al fine di stabilire una diagnosi di infezione in atto, nei casi in cui le indagine sierologiche non consentano interpretazioni sicure, la ricerca del virus mediante la rilevazione, con idonee metodiche di amplificazione (PCR), della presenza di DNA provirale nei linfomonociti circolanti, costituisce il tipo di indagine di maggiore affidamento in quanto la sua positività è costante in tutti i soggetti infetti, indipendentemente dalla presenza di replicazione virale (Figura 1).

 

 

DIAGNOSI DI INFEZIONE DA HIV
Primo livello	.		ELISA
		NEG	BORDERLINE	POS	Anamnesi
					NEG	POS
Secondo livello			IMMUNOBLOTTING
		NEG	INDETERMINATO	POS
Se i risultati della sierologia, ripetuta dopo un’attesa di 5-6 settimane, riportano a questo punto dell’algoritmo
Terzo livello                                 PCR (DNA provirus)

 

FIGURA 1: possibile flusso delle operazioni diagnostiche. La negatività della ricerca di anticorpi mediante  reazione immunoenzimatica (ELISA) o la positività della stessa reazione in un soggetto con un’anamnesi positiva (presenza di comportamenti “a rischio”) non lasciano dubbi interpretativi. Una reazione immunoenzimatica dubbia (borderline) o positiva ma in un soggetto con anamnesi negativa, prevedono necessariamente la ripetizione dell’esame su un secondo campione di siero prelevato immediatamente ed eventualmente la successiva conferma del risultato mediante immunoblotting.  Nel caso in cui le reazioni sierologiche si mantengano di dubbia interpretazione (borderline/indeterminato) anche se ripetute dopo qualche settimana, è necessario ricorrere alla ricerca del DNA provirale, per dirimere definitivamente il quesito diagnostico.

 

 

Il follow-up del paziente infetto

 

Nel follow-up del paziente infetto, nel quale evidentemente l’infezione è definitivamente accertata, quello che è essenziale, non è più stabilire o meno la presenza del virus, ma piuttosto accertarne il livello di replicazione, misurando la quantità di virus (il cosiddetto “viral load” o “carico virale”) presente in circolo.

I parametri virologici in grado di dare utili indicazioni sul “viral load” sono fondamentalmente rappresentati da: 1) determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue periferico (infectious culture dose o ICD) misurata in colture di cellule in vitro, 2) determinazione quantitativa del DNA provirale mediante PCR (DNA/PCR), 3) determinazione dei livelli plasmatici di antigeni virus-specifici, utilizzando a questo scopo la quantificazione della principale proteina presente nel virione maturo e rappresentata dalla proteina capsidica p24 (antigenemia), 4) determinazione quantitativa di RNA virionico nel plasma.

Ancorchè i singoli criteri di valutazione del viral load presentino ciascuno limiti di significatività e di applicabilità nelle varie fasi evolutive dell’infezione, essi sono tutti correlati in modo abbastanza soddisfacente tra di loro e con la progressione e la gravità della malattia.

La determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue periferico (ICD) è, comunque, una pratica indaginosa che, come abbiamo già detto, è possibile solo in laboratori particolarmente attrezzati, e può anche risultare non abbastanza sensibile.

La DNA-PCR, misura la quantità di virus “latente” (provirus) che rappresenta esclusivamente un’indicazione dell’ampiezza del “reservoir” di virus presente nell’organismo, peraltro non sempre e non necessariamente correlata alla intensità della replicazione virale produttiva tuttavia, almeno in alcune circostanze (ad esempio nei soggetti in cui la terapia riesca a bloccare, almeno temporaneamente, la replicazione virale), può rappresentare l’unico parametro virologico quantificabile ed ha quindi precise indicazioni di impiego nel follow-up del paziente.

La determinazione dei livelli plasmatici di p24  è estremamente agevole dal punto di vista tecnico e, purchè condotta previa dissociazione degli eventuali immunocomplessi (allo scopo di evitare il “mascheramento” di una quota più o meno consistente dell’antigene virale ad opera degli anticorpi prodotti nell’organismo infetto), è sufficientemente sensibile ed è correlata in modo accettabile alla intensità della replicazione virale.

Non si può, tuttavia, non prendere atto del fatto che tutte le più recenti sperimentazioni di nuovi regimi terapeutici e tutti i protocolli che ne sono derivati, fanno riferimento al “viral load” misurato attraverso le più costose e sofisticate metodiche (RT-PCR, NASBA, bDNA) per la determinazione quantitativa di RNA virionico nel plasma e che il “viral load” espresso come numero di molecole di HIV-1 RNA/ml di plasma rappresenta, ormai, il criterio fondamentale (insieme alla presenza di infezione “sintomatica” e/o al numero di linfociti T CD4⁺) sia per impostare la terapia con farmaci antiretrovirali, sia per valutare l’efficacia del regime terapeutico in atto e la prognosi della malattia.

 

 

La farmaco-resistenza di HIV. Un problema fondamentale della terapia.

 

L’introduzione relativamente recente di regimi terapeutici basati sulla contemporanea somministrazione di diversi inibitori della trascrittasi inversa (inibitori nucleotidici e non-nucleotidici) e di inibitori della proteasi virus-specifica i quali, pur con effetti secondari non trascurabili a livello di tossicità per l’organismo, sono in grado di ridurre, in modo efficace, la replicazione del virus nella maggior parte dei soggetti infetti, ha portato ad alcuni cambiamenti radicali a livello epidemiologico, che sono consistiti soprattutto in un calo significativo del numero di pazienti che necessitano di ricovero ospedaliero e nel crollo della mortalità specifica.

La disponibilità di farmaci ragionevolmente efficaci, è però bilanciata dalla frequente  insorgenza di stipiti virali resistenti a tutti o a parte dei farmaci impiegati, per la comparsa di mutazioni nei geni che codificano le proteine-bersaglio dei diversi farmaci, con la conseguenza di una molto minore affinità del farmaco per la proteina-bersaglio modificata, che tuttavia continua a svolgere la sua funzione “fisiologica” nell’economia replicativa del virus.

Il genoma di HIV, infatti,

 

come quello degli altri membri della famiglia Retroviridae, presenta un complesso ciclo replicativo, nel quale intervengono ben tre sistemi enzimatici diversi, di cui uno virale (trascrittasi inversa) e due cellulari (DNA polimerasi e RNA polimerasi). Il genoma dei  retrovirus, quindi, essendo sottoposto agli “errori di copiatura” di ben tre diversi sistemi enzimatici, può godere di una notevole variabilità che gli consente la capacità di esplorare gli effetti di un altrettanto notevole spettro di possibili condizioni di pressione di selezione positiva. Mentre l’attività della DNA polimerasi e della RNA polimerasi cellulare che provvedono, rispettivamente, alla replicazione del provirus integrato nel genoma cellulare ed alla trascrizione degli RNA da esso codificati, sono enzimi la cui attività è controllata da una serie di sistemi “correttivi”, la frequenza di errori nella trascrizione inversa (che trasforma le molecole di RNA virionico in altrettante molecole di DNA provirale che si integra nel genoma delle cellule sensibili) è relativamente alta, con una conseguente elevata frequenza di errate incorporazioni di nucleotidi, che si traducono, a loro volta, in altrettante “mutazioni”, molte delle quali compatibili con il mantenimento della capacità replicativa del virus mutato.

Da ciò consegue che mentre il virus infettante è formato da una popolazione di virioni con un genoma relativamente omogeneo, man mano che l’infezione progredisce la popolazione virale, a causa dell’alto tasso di replicazione del virus e della concomitante comparsa di continue mutazioni, diventa sempre più genomicamente disomogenea, fino a  raggiungere un milioni di “varianti”, con più o meno consistenti modificazioni in una o più sequenze mucleotidiche, nel paziente asintomatico ed oltre 100 milioni di varianti nel paziente in fase avanzata di malattia. 

Considerato che il genoma di HIV è composto da poco meno di 10.000 basi, è facile comprendere come sia possibile reperire nell'organismo, entro poche settimane-mesi dall'infezione, una serie di particelle virali contenenti pressocchè tutte le possibili mutazioni non-letali (ovverosia compatibili con l’attività replicativa del virus), tra cui una serie di mutazioni non-letali che interessano il gene “pol” che codifica sia la trascrittasi inversa (necessaria alla retro-trascrizione della molecola di RNA del genoma virionico nel DNA provirale), sia la proteasi virus-specifica (necessaria alla definitiva liberazione delle proteine virus-specifiche dalle poliproteine prodotte nella fase iniziale del processo traduttivo) le quali, di conseguenza, possono risultare variamente modificate (pur mantenendo l’originaria attività catalitica) e con una molto minore affinità per i farmaci inibitori specifici. 

Con l’inizio della terapia farmacologia è naturale che i subset di virus che presentano mutazioni che conferiscono loro la “resistenza” ai farmaci impiegati, prendano rapidamente il sopravvento e quando il loro numero diventi consistente, o addirittura preponderante, possono vanificare l’efficacia terapeutica dei farmaci.

Proprio per limitare al massimo questo inconveniente, la terapia viene di norma effettuata con la somministrazione contemporanea di farmaci con diverso meccanismo d’azione, ed è necessario controllare periodicamente la sensibilità/resistenza nei confronti delle diverse classi di farmaci disponibili, della popolazione virale di ogni singolo paziente, allo scopo di cercare di modulare il regime terapeutico nel modo migliore.

L’analisi della la sensibilità/resistenza nei confronti delle diverse classi di farmaci è possibile sia con metodi fenotipici sia con metodi genotipici.

I test fenotipici consistono attualmente nel determinare la capacità del virus isolato dal paziente, di moltiplicarsi in colture di cellule in vitro mantenute in presenza di dosi adeguate del farmaco che si desidera saggiare. I test fenotipici sono di interpretazione facile e sicura. Infatti, se il virus si moltiplica nelle colture cellulari in presenza del farmaco, evidentemente esso è “resistente” (o meglio, nella popolazione virale che infetta il paziente è presente una quota apprezzabile di virioni “resistenti”), mentre se non si osserva moltiplicazione, è chiaro che la popolazione virale infettante è omogeneamente  “sensibile”. I test fenotipici, però, richiedono laboratori adeguatamente attrezzati per l’isolamento e la coltivazione di HIV in colture di cellule in vitro, sono di esecuzione complessa, richiedono tempi lunghi ed i costi, al momento, sono estremamente elevati. 

I test genotipici consistono nella ricerca diretta nel genoma virale, amplificato direttamente dal materiale patologico ed impiegando idonei strumenti molecolari, la presenza di mutazioni (a tutt’oggi ne sono state identificate almeno 100) correlate alla presenza di farmaco-resistenza. I test genotipici prescindono dall’impiego di colture cellulari, sono relativamente poco costosi ed i tempi necessari per ottenere una risposta utile risultano abbastanza contenuti (3-5 giorni). L’interpretazione “lineare” dei test genotipici, però, non è sempre facilissima, essendo che le mutazioni evidenziabili, o almeno alcune di esse, non sono costantemente associate al carattere fenotipico di “resistenza” alle dosi di farmaco utilizzabili in terapia.

In entrambi i casi, i livelli di sensibilità non sono estremamente elevati, essendo, ambedue i tipi di test, in grado di evidenziare la presenza di subset di virus portatori di mutazioni associate a farmaco-resistenza solo se presenti nel 20% o più della popolazione virale in osservazione.

 

Pur con queste limitazioni, lo studio della farmaco-resistenza della popolazione virale presente nel paziente, rappresenta oggi uno degli elementi essenziali del ventaglio di indagini virologiche ed immunologiche da effettuare, prima di iniziare o di modificare il trattamento farmacologico, al fine di circoscrivere al massimo i possibili rischi di insuccesso terapeutico.

 

[Prof.ssa Maria Carla Re - Professore Straordinario Microbiologia e Microbiologia Clinica - Facoltà di Medicina e Chirurgia Università degli Studi di Bologna]